Saturday, 28 April 2012

How do SPRI beads work?

Someone recently asked me, “how do SPRI beads work” and I realized I was not completely sure so I went to find out.

My lab uses kits. Lots and lots of kits; kits for DNA extraction, kits for PCR, kits for NGS library prep and kits for sequencing. Kits rock! But understanding what is going on at each stage of the protocol provided with the kit really helps with troubleshooting and modification. How many people have added 24ml of 100% Ethanol to a bottle of Qiagen’s PE buffer without stopping to ask what is already in the bottle? The contents of the PE bottle are… answer at the bottom of this post.

I hope this post helps you understand SPRI a bit better and think of novel ways to use it. I’d recommend reading A scalable, fully automated process for construction of sequence-ready human exome targeted capture libraries in Genome Biology 2011 for the with-bead methods discussed at the bottom of this post. I am sure we'll all be using their method a lot more in the future!

You are most likely to come across SPRI beads labeled as Ampure XP from Beckman.

First some handling tips:
  • Vortex beads before use.
  • Store beads at the correct temperature.
  • Allow enough time for beads to come to room temperature.
  • Pipetting is critical; use very careful procedures (SOPs) and well calibrated pipettes.
How do SPRI beads work? Solid Phase Reversible Immobilisation beads were developed at the Whitehead Institute (DeAngelis et al 1995) for purification of PCR amplified colonies in the DNA sequencing group. SPRI beads are paramagnetic (magnetic only in a magnetic field) and this prevents them from clumping and falling out of solution. Each bead is made of polystyrene surrounded by a layer of magnetite, which is coated with carboxyl molecules. It is these that reversibly bind DNA in the presence of the “crowding agent” polyethylene glycol (PEG) and salt (20% PEG, 2.5M NaCl is the magic mix). PEG causes the negatively-charged DNA to bind with the carboxyl groups on the bead surface. As the immobilization is dependent on the concentration of PEG and salt in the reaction, the volumetric ratio of beads to DNA is critical.

SPRI is great for low concentration DNA cleanup that is why it is used in so many kits. The reagents are easy to handle and a user can process 96 samples very easily in a standard plate. Alternatively the protocol can be easily automated and tens or hundreds of plates can be run on a robot in a working day. The binding capacity of SPRI beads is huge. 1ul of AmpureXP will bind over 3ug DNA.


This is the typical SPRI protocol from Beckmans website.

Size-selection with SPRI: Again the concentration of PEG in the solution is critical in size-selection protocols so it can help to increase the volume of DNA you are working with by adding 10mM Tris-HCL pH 8 buffer or H2O to make the pipetting easier. The size of fragments eluted from the beads (or that bind in the first place) is determined by the concentration of PEG, and this in turn is determined by the mix of DNA and beads. A 50ul DNA sample plus 50ul of beads will give a SPRI:DNA ratio of 1, as will 5ul pipetting (but much harder to get right). As this ratio is changed the length of fragments binding and/or left in solution also changes, the lower the ratio of SPRI:DNA the higher larger the final fragments will be at elution. Smaller fragments are retained in the buffer usually discarded and so you can get different size ranges from a single sample with multiple purifications. Part of the reason for this effect is that DNA fragment size affects the total charge per molecule with larger DNAs having larger charges; this promotes their electrostatic interaction with the beads and displaces smaller DNA fragments
SPRI size selection from Broad "boot camp"
SPRI size selection from Broad "boot camp"
.
Broad Boot Camp http://www.broadinstitute.org/scientific-community/science/platforms/genome-sequencing/broadillumina-genome-analyzer-boot-camp


With-bead SPRI cleanup: An incredibly neat modification of SPRI clean-up is the “with-bead” method developed by Fisher et al in the 2011 Genome Biology paper. Rather than using SPRI to clean-up discrete steps in a protocol these are integrated into a single reaction tube method, thus reducing the number of liquid transfer steps. After each step DNA is bound to beads by addition of the 20% PEG, 2.5M NaCl buffer, washes are performed as normal with 70% ethanol but the DNA is not eluted and transferred. Rather the master-mix for the next step in the protocol is added directly to the tube. The final DNA product is eluted from beads for further processing e.g. Illumina sequencing. This modification increases DNA yields in Illumina library prep as multiple transfer steps are removed, reducing the amount of DNA lost at each transfer.


How will you use SPRI in your lab?

PS: the Qiagen PE bottle contains 6ml of water.

PPS: If DNA and Carboxyl are both negatively charged what is happening on a SPRI bead? There appears to be a bit of a black hole in the literature I read through about how the SPRI beads actually work at the molecular level. Digging around some more it appears that the PEG can induce a coil-to-globule state change in the DNA with the NaCl helping to reduce the dielectric constant of the solvent, PEG also acts as a charge-shield. These mechanisms may be behind the "crowding" talked about on other sites. Perhaps someone out there can enlighten me?


Refs:
Lis JT. Size fractionation of double-stranded DNA by precipitation with polyethylene glycol Methds Ezymol (1975)
Lis J. Fractionation of DNA fragments by polyethylene glycol induced precipitation. Methds Ezymol (1980)
DeAngelis et al. Solid-phase reversible immobilization for the isolation of PCR products. NAR (1995)
Hawkins et al. DNA purification and isolation using a solid-phase. NAR (1994)

90 comments:

  1. Thanks for the insight. I have a question about the mechanism of DNA binding by the beads. You mentioned carboxyl molecules. Carboxyl group is negative once dissociated from the proton, so how does it bind DNA, which is also negative?

    ReplyDelete
    Replies
    1. The addition of PEG leads to "depletion" effect, i.e., the PEG molecules push DNA aggregating. The high NaCl concentration helps this effect ("salting-out"). This salting-out and depletion effects promote the binding of the carboxylic groups on beads surface with DNA via hydrogen bonding.

      Delete
  2. It turns out that by answering one person's question I have inevitably generated other questions along the way. I have updated the end of the blog to try and start answering the "negative charge" questions. However I don't understand the chemistry at the molecular level and am hoping someone more knowledgeable can help.

    ReplyDelete
    Replies
    1. The carboxyl group is "activated" in the presence of acid solution---a hydrogen on the carboxyl group becomes positively charged thus attracting the negatively-charged DNA.

      Delete
    2. The working solution is pH 8, so the carboxylate will have a negative charge.

      Delete
  3. To be longer-winded, I think Anonymous is suggesting that at a low enough pH the carboxyl group is protonated, not ionised, and that with the electronegativity of two adjacent oxygen atoms it is showing an induced positive charge (not a full positive charge like a proton or sodium ion would carry, but partial positive charge due to the electrons from the O-H sigma bond hanging out around the oxygen nuclei more of the time). Seems reasonable, depending on the pH, and assuming that the phophoryl groups of the DNA backbone remain deprotonated whilst the carboxyl groups of the beads are (mostly) protonated. Anyone know the pKa values??

    ReplyDelete
  4. James, I don't suppose you could tell us what (if any!) the difference in buffer is for Sanger sequencing reaction cleanup (ie: ssDNA of 25-1000 bases) ?

    ReplyDelete
  5. The pKA of a carbonyl group RCOOH is ~15ish. Could this work by a chaotropic effect?

    Negative carboxyl-positive salt-negative DNA

    ReplyDelete
  6. Does anyone know what the difference is between RNA and DNA selective SPRI beads?

    ReplyDelete
  7. RNA are quaranteed RNAse free

    ReplyDelete
  8. To my mind that's exactly what I refer to a lovely blog article! Do you utilize this site for your private joy solely or you still exploit it profit wise?

    ReplyDelete
  9. Excellent blog you have here. I’m a long time reader, but haven’t commented before; I just had to say how much I enjoy the site. Where did you get this Wardress theme? Is it custom? I really like it next-generation sequencing and microarray technologies.

    ReplyDelete
  10. Hi James@cancer,
    I loved reading this piece! Well written!

    Merlen Hogg
    Tormod Helleland

    ReplyDelete
    Replies
    1. You wouldn't happen to know what molecular weight the PEG is would you? Or does that not matter?

      Delete
    2. I use PEG 8000. I ligate adapters on the beads, and reuse the beads for following step with 20 % PEG (8.000), 2.5 M NaCl.

      Delete
  11. Is there a method to recycling the beads?

    ReplyDelete
  12. My lab uses kits. Lots and lots of kits

    And it shows.

    PS: the Qiagen PE bottle contains 6ml of water

    False! As as scientist, you should attempt to do at least minimal experimentation before making any claims.

    The Qiagen PE bottle contains 50 mM Tris pHed to 7.6 with HCl. Go ahead and test PE for pH, Cl- and secondary amines.

    True, substituting Tris for water does not make that much of a difference but the residual protein contamination is definitely higher when unbuffered 80% ethanol is used.

    Also true that it is completely retarded to buffer at 7.6 with Tris but with the Tris being molecular biologists' favorite reagent, one can hardl;y expect anything else...

    ReplyDelete
    Replies
    1. The pKa of tris is ~8. I was taught that a buffering reagent is generally effective at ±1 the pKa. Ie tris is suitable for 7-9.

      why is it "retarded" to buffer at 7.6 with tris?

      Delete
  13. Informative discussion!!
    Can anyone please help tell me the reason of DNA loss while undergoing SPRI purification of the sheered DNA?

    ReplyDelete
    Replies
    1. To my experience the binding capacity of the beads is as low as 30ng DNA/ul beads. You should perform some tests to figure out the capacity of the beads under your conditions.

      Delete
  14. The comments above assume that the DNA binds "magically" to the beads due to carboxylated coatings. This same myth runs with the use of silica as well. Bottom line is the carboxyls are on the surface to lightly repel the DNA off the surface once the DNA-bead aggregate is place in an aqueous solution that allows the DNA to fully hydrate back into solution phase.

    The other reason for carboxyl groups is shield the DNA from coming in contact with sticky plastic surface (or silica)- i.e. use of nylon, for Southern blots or polystyrene for ELISA.

    The process of DNA capture on a bead surface is the same as process of precipitating DNA for centrifugal collection. The long complex polymer of DNA remains in solution phase due to the structured water layer or cloud that forms around the DNA polymer primarily due to hydrophilic/ionic interaction of (deoxy)ribosugar-phosphate backbone of the nucleic acid. When "water hungry" alcohols or polyalcohols (PEG) are added to very high concentrations, the water cloud is disrupted, becomes significantly thinner, which results in the DNA transitioning from solution phase to a flocculated or precipitated phase. DNA transitions from a long polymer water cloud, coated polymer to water-stripped condensed "sticky ball". These DNA "balls" will stick to or aggregate with each other or to any surface that the ball collides into, surface such as that of a bead, fiber, or membrane. This flocculation process can be induced with adding salts to high concentrations, i.e. sodium perchlorate, ammonium acetate, lithium chloride, and with proteins the use of alcohols or high concentration of sulfate salts.

    In reference to carboxyl and bead surface; if the surface was coated with amines, the DNA (via phosphate backbone) would adsorb to the surface via ionic bonds and not elute from bead surface. This ionic adsorption would occur with metal oxide surfaces including semi metal oxides such as silica if Lewis acid sites are exposed - which is common with most materials.

    Nucleic acids have been isolated using plastic, silane, silica, ferrite, or even clay beads/particles. For all cases if the surface is pretreated with a starch, proteins or some other slightly negative charged coating, which shields the surface from DNA, the DNA easily elutes from the surface. Thus by coating the silica or plastic surface with carboxyl groups, the DNA when it transitions to fully hydrated form during elution phase will be ionically repelled by carboxyl coated surface.

    Side note, smaller nucleic acid polymers are more soluble in these alcohol solutions due to their smaller size - form smaller condensed balls. Cold or time will allow the smaller balls to aggregate form larger balls and increase surface area of the ball to stick to a solid support or be spun out by centrifugation.

    So I hope this helps in dismissing the myth that DNA has special ionic attraction to carboxyl or silicon oxide surface and that the process is due to physical chemistry of flocculation / precipitation process.

    ReplyDelete
    Replies
    1. What would you suggest when you want to focus on smaller fragments? Since the beads are usually washed with 70-80% alcohol it seems to be more likely to lose the small fragments if I understood your side not correctly. When you say "cold or time" would help, were you referring to the DNA binding condition? How cold is "cold"? And in what way can I get rid of the large fragments but keep (only) the small ones?
      Thanks

      Delete
  15. Additional comments to above tirade by the same author; Guanidinium salts (i.e. chloride or isothiocyanate salts) like alcohols, PEG, and acetate or sulfate salts, at high concentrations, with or without alcohol, cause DNA to precipitate / flocculate out of solution phase as well.

    Look up the "Rene Boom" papers using this salt with silica based solid phase to isolate DNA.

    Below is most cited with abstract- though look up the 1999 paper as well.
    _____
    Rapid and simple method for purification of nucleic acids.

    Boom R, Sol CJ, Salimans MM, Jansen CL, Wertheim-van Dillen PM, van der Noordaa J.

    Source: J. Clinical Microbiology (1990) 28 (3) 495 - 503.

    Department of Virology, Academic Medical Center, Amsterdam, The Netherlands.
    Abstract

    We have developed a simple, rapid, and reliable protocol for the small-scale purification of DNA and RNA from, e.g., human serum and urine. The method is based on the lysing and nuclease-inactivating properties of the chaotropic agent guanidinium thiocyanate together with the nucleic acid-binding properties of silica particles or diatoms in the presence of this agent. By using size-fractionated silica particles, nucleic acids (covalently closed circular, relaxed circular, and linear double-stranded DNA; single-stranded DNA; and rRNA) could be purified from 12 different specimens in less than 1 h and were recovered in the initial reaction vessel. Purified DNA (although significantly sheared) was a good substrate for restriction endonucleases and DNA ligase and was recovered with high yields (usually over 50%) from the picogram to the microgram level. Copurified rRNA was recovered almost undegraded. Substituting size-fractionated silica particles for diatoms (the fossilized cell walls of unicellular algae) allowed for the purification of microgram amounts of genomic DNA, plasmid DNA, and rRNA from cell-rich sources, as exemplified for pathogenic gram-negative bacteria. In this paper, we show representative experiments illustrating some characteristics of the procedure which may have wide application in clinical microbiology.

    ReplyDelete
    Replies
    1. What makes the aggregated DNA prefer the beads versus the surface of the container the solution is in? Or is there no preference and we merely exploit that the beads have a much larger surface area than the container?

      Delete
  16. Hi, thank you for the very informative blog!

    I was wondering whether the initial buffer composition would affect binding of the DNA to the beads? I am planning to purify ChIP DNA material with SPRI beads but my elution buffer contains 1% SDS and 0.1M NaHCO3. Not sure if these conditions wouldn't be too harsh...

    Thanks!

    ReplyDelete
    Replies
    1. Hi, I was planning to try the same. Did you already try to purify your ChIP samples with the beads. Did it work?

      Delete
  17. Please bear with me as this is entirely new to me. If I purchase the Agencourt AMPure XP kit, and I need to retain DNA >600 but definitely eliminate DNA <200 then I can simply alter the prescribed 1.8 X Reaction Volume so that it is, according to the gel image above, 0.5X ?? Can I then reuse the beads for additional reactions? I see PEG mentioned above, is that contained in the AMPure mix? If I can reuse the beads, what do I resuspend them in to recreate the original bead mixture?

    Thanks again for your patience. By the way, this post has helped me come close to understanding what is going on. Thanks.

    ReplyDelete
  18. Hi! I use AMpure beads to clean-up my ChIPseq libraries and use the Resuspension Buffer from BIOO Scientific's Nextflex ChIPseq-kit. Anyone who has an idea of what that contains or what I could use instead?
    Thanks!

    ReplyDelete
  19. you describe about this topic really well thankssigma antibody

    ReplyDelete
  20. Great post, thank you for all the info! I was wondering if you had a general idea of the ratio of 20% PEG solution to beads in a with-bead library prep? We are wanting to try this with Agilent SureSelect library prep, which uses a post-shear bead volume of 180ul. Thank you for any insights!

    ReplyDelete
  21. Nice start guys...I went through the website and I found that you made a decent point here. Keep up the topic that everyone can choose one of the best. Thanks.Sigma antibody

    ReplyDelete
  22. I found your blog when I was looking for a different sort of information but I was very happy and glad to read through your blog. The information available here is great. . I know something information, to know you can click here

    water softener
    water filter

    ReplyDelete
  23. has any tested this for genomic DNA purification from tissue? any recommendations?

    ReplyDelete
  24. If SPRI beads are charged is there the possibility of any problems with pipetting with conductive tips for example in automated workstations?

    ReplyDelete
  25. I had been trying to remove the Illumina adapters ~120bp from my PCR amplified product. At 0.7:1 Ampure beads ratio I am still unable to remove the 120bp fragments. Is it necessary to add additional PEG solution and if so what is the % of PEG to add?

    ReplyDelete
    Replies
    1. You get better adapter-dimer removal by doing two rounds of clean-up than reducing the bead concentration.
      You can also try titrating the adapters down. That way, there's less chance of creating dimers in the first place.

      Delete
  26. Great piece of writing, thank you for taking the time to be so thorough.

    ReplyDelete
  27. Had no idea what a SPRI bead was before reading this. Now I know. Thanks!
    -Jackie @ construction site cleanup

    ReplyDelete

  28. I read that Post and got it fine and informative. Please share more like that...
    office cleaning richmond

    ReplyDelete
  29. Thank you for your post. This is excellent information. It is amazing and wonderful to visit your site.
    metabolic dna testing

    ReplyDelete
  30. Anonymous23 May 2014 at 08:13
    What would you suggest when you want to focus on smaller fragments? Since the beads are usually washed with 70-80% alcohol it seems to be more likely to lose the small fragments if I understood your side not correctly. When you say "cold or time" would help, were you referring to the DNA binding condition? How cold is "cold"? And in what way can I get rid of the large fragments but keep (only) the small ones?
    Thanks

    ReplyDelete
  31. I found your blog when I was looking for a different sort of information but I was very happy and glad to read through your blog. The information available here is great. . I know something information, to know you can click hereRetial cleaning services melbourne

    ReplyDelete
  32. I found your blog when I was looking for a different sort of information but I was very happy and glad to read through your blog. The information available here is great. . I know something information, to know you can click hereRetial cleaning services melbourne

    ReplyDelete
  33. thanks, great post! love getting into the basics

    ReplyDelete
  34. Hi Laura, sometimes we forget that we ever learned them at all!

    ReplyDelete
  35. شركة تنظيف بالطائف
    شركة المنزل تقدم لكم افضل خدماتها فى التنظيف بأفضل الاسعار فهى شركة تنظيف بالطائف تقوم بكافة خدمات التنظيف وبأستخدام اجود المنظفات فهى شركة تنظيف فلل بالطائف, تنظيف منازل بالطائف, تنظيف مجالس بالطائف, تنظيف شقق بالطائف
    شركة تنظيف فلل بالطائف
    http://elmnzel.com/cleaning-taif/

    ReplyDelete
  36. أفراد شركة الفرسان أفضل شركة نظافة عامة بجدة
    يستخدمون افضل مواد التنظيف لتنظيف مستوي عالي

    ReplyDelete
  37. تستخدم شركة الفرسان افضل شركة نظافة عامة بجدة احدث التقنيات والادوات في التنظيف

    ReplyDelete
  38. يوجد مجموعة من الخدمات التي تقدمها شركة غسيل كنب في مكة بافضل النتائج علي ايدي عماله خبره

    للتواصل عبر:

    http://www.el3nod.com/3/company-cleaning-moquette-carpet-sofas-mecca

    ReplyDelete
  39. Does anyone know if using 15,000-20,000 PEG will work the same way as using 8000 PEG? I notice on the 15k-20k PEG it says that it's made using M.W. 7000-9000 PEG that is internally joined by an aromatic ring, so I wonder if the two arms of 7k-9k avg polymer will work the same...

    ReplyDelete
  40. Hello!
    You have very interesting blog with winderful posts, thank you for creating this all and sharing with us :)
    I learned alot on the topic of how do SPRI beads work, thank you! Best wishes

    ReplyDelete
  41. I am very happy and glad to read through your blog.

    Thanks,

    Crude Oil Sure Shot Calls

    ReplyDelete

  42. Create short url موقع اختصار الروابط
    paste your long url below to shorten. Enter one or more long urls below. Short Url Domain: Agree with our terms. create url
    Create short url موقع اختصار الروابط http://www.3nwan.net/vb
    http://www.sheikhmaghreb.com/

    ReplyDelete
  43. شركة الاسراء وشركة تنظيف.كوم لعمليات التنظيف داخل وخارج المملكه
    زورونا من هنا
    شركة الاسراء للتنظيف
    شركة تنظيف.كوم

    ReplyDelete
  44. شركة تنظيف خزانات بالمدينة المنورة المشرق كلين 0538993522

    الجميع لايستغنى عن المياه فهى مصدر الحياة وللحافظ عليها نظيفة نقية لابد من حمايتها عن طريق الخزانات فشركة المشرق أفضل
    شركة تنظيف خزانات بالمدينة المنورة
    فمعنا لاداعى للقلق من تنظيف الخزانات فنحن
    شركة غسيل خزانات بالمدينة المنورة
    نقوم بعميلة التنظيف على اكمل وجه


    شركة تنظيف خزانات بالمدينة المنورة
    شركة غسيل خزانات بالمدينة المنورة
    شركة عزل خزانات بالمدينة المنورة
    شركة كشف تسربات المياه بالمدينة المنورة


    http://mashriq-clean.com/%D8%AA%D9%86%D8%B8%D9%8A%D9%81-%D8%AE%D8%B2%D8%A7%D9%86%D8%A7%D8%AA-%D8%A8%D8%A7%D9%84%D9%85%D8%AF%D9%8A%D9%86%D8%A9-%D8%A7%D9%84%D9%85%D9%86%D9%88%D8%B1%D8%A9/

    ReplyDelete
  45. شركة تنظيف بالبخار بمكة السهم الذهبى 0558842225

    شركة تنظيف بمكة ريحت بالك في التنظيف وبتقولك هنظفلك منزلك بالبخارى التنظيف بالبخار غير ضار بالبيئة؛ نظرًا لعدم وجود مواد كيميائية.

    شركة غسيل بالبخار بمكة
    شركة تنظيف شقق بمكة
    شركة تنظيف خزانات بمكة

    http://golden4clean.com/%D8%BA%D8%B3%D9%8A%D9%84-%D8%A8%D8%A7%D9%84%D8%A8%D8%AE%D8%A7%D8%B1-%D8%A8%D9%85%D9%83%D8%A9/

    ReplyDelete
  46. شركة تنظيف بجدةالدانة كلين
    0508554570
    تنظيف بجدة من اهم الخدمات التى تقدمها
    شركة تنظيف بجدة
    دة تقدم لكل عملائها افضل خدمات التنظيف فى جدة حيث تنتشر فروعها فى كثير من مناطق المملكة حيث تقدم الدانة كلين كل انواع التنظيف (تنظيف البيوت –والشركات – والشاليهات –والمستشفيات –شركة تنظيف منازل بجدة – القصور – تنظيف الخزانات – والبيارات كنب – مجالس ) وغيرها
    شركات النظافة بجدة
    شركة تنظيف بجدة
    شركة تنظيف بيوت بجدة
    شركة تنظيف شقق بجدة
    شركة تنظيف منازل بجدة
    شركة تنظيف فلل بجدة
    شركة تنظيف سجاد بجدة
    شركة تنظيف كنب بجدة
    شركة نظافة بجدة
    شركات تنظيف منازل بجدة
    شركة تنظيف موكيت بجدة
    شركة تنظيف مجالس بجدة
    شركة تنظيف ستائر بالبخار بجدة
    شركة تنظيف مقروشات بجدة
    شركة تنظيف بالبخار بجدة
    شركة تنظيف مجالس بالبخار بجدة

    شركة نظافة بجدة


    http://aldanaa.com/%D8%AA%D9%86%D8%B8%D9%8A%D9%81-%D8%A8%D8%AC%D8%AF%D8%A9/

    ReplyDelete
  47. سباك بالمدينة المنورة -الصيانة السريعة – 0508353932

    سباك بالمدينة المنورة يعرفكم بان
    شركة اعمال سباكة بالمدينة المنورة
    من المعروف انها كثيرة ومتعددة ومنها الاعمال الداخلية وفى كثير من الاحيان ستحتاج لفنى سباك بالمدينة المنورة ووقتها لاتبحث كثيرا فمؤسسة الصيانة السريعة
    رقم فنى سباك منازل بالمدينة المنورة
    رقم فنى سباك منازل بالمدينة المنورة
    سباك بالمدينة المنورة
    سباك منازل بالمدينة المنورة
    شركة اعمال سباكة بالمدينة المنورة
    فنى سباك بالمدينة المنورة
    فنى سباك لصيانة اعمال السباكة بالمدينة المنورة
    فنى سباكة لصيانة اعمال لاعطال بالمدينة المنورة
    معلم سباكة بالمدينة المنورة

    http://alcyana.com/%D8%B3%D8%A8%D8%A7%D9%83-%D8%A8%D8%A7%D9%84%D9%85%D8%AF%D9%8A%D9%86%D8%A9-%D8%A7%D9%84%D9%85%D9%86%D9%88%D8%B1%D8%A9/

    ReplyDelete
  48. Excellent blog posted here. If anyone looking for steel fibres for concrete then you can contact Precision Drawell. Thanks for sharing.

    ReplyDelete
  49. I really appreciate your article. the post has excellent tips which are useful. this post is good in regards of both knowledge as well as information. Thanks for sharing it.Steam cleaning company in Mecca

    ReplyDelete


  50. شركة تنظيف مفروشات بالمدينة المنورة
    شركة بيتى هى كبرى شركات التنظيف بالمدينة المنورة لدينا العمالة المدربة التى تقوم بخدمات التنظيف باستخدام اجود انواع المنظفات المستوردة التى تقضى على اصعب البقع والاوساخ التى تتراكم على السجاد والموكيت والمفروشات وعمالتنا متخصصة فى تنظيف المطابخ والاوانى والغرف والمسابح والمنازل والشقق بالمدينة المنورة والفيلات والقصور بالمدينة المنورة كما اننا لدينا خدمات التنظيف بالبخار للكنب والسجاد والموكيت والمفروشات بالمدينة المنورة وجميع عماتنا عمالة مدربة تقوم بجميع خدمات التنظيف بأرخص الاسعار
    شركة تنظيف كنب بالمدينة المنورة
    http://www.bateiy.com/cleaning-medina/

    ReplyDelete

  51. شركة تاج لتسليك المجارى بالدمام 0551844053 تمتلك الشركة افضل الادوات المثاليه المستخدمه فى عمليات تسليك المجارى
    شركة تسليك مجارى بالدمام
    بالدمام والتى تمتلك الخبره الكافيه لذلك والتى تعتمد على عماله فنية مدربه على اعلى مستوى من الدقه والمهاره فى تنفيذ
    كل ما هو مطلوب من الطاقم المرسل اليك عزيزى العميل وذلك لتلبية جميع طلباتك عزيزى العميل كل ما عليك هو ان تبادر
    بالاتصال بافضل شركة تسليك مجارى بالدمام نقوم فى شركة تاج باستخدام افضل الاساليب العلميه الحديثه والطريقه
    المثاليه والصحيحه لعملية تسليك المجارى بالدمام نقوم بتسليك للحمامات بالدمام وتسليك صفايات الحمامات اثناء وجود تسليك وشركة تسليك
    مطابخ بالدمام من اوائل الشركات التى تعتمد على افضل الطرق الحديثه والتى تستخدمها شركة تاج 0551844053 تسليك مجارى بالدمام
    التى اصبحت فى طليعة شركات التسليك بالدمام ولا تقل اهمية عن شركة طيوب لتسليك المجارى بالدمام
    شركة تسليك مجارى بالقطيف
    شركة تسليك مجارى بالخبر
    شركة تسليك مجارى بالجبيل
    شركة تسليك مجارى بصفوى وسيهات وراس تنورة
    شركة تسليك مجارى بخميس مشيط
    شركة تسليك مجارى بالرياض
    شركة طيوب لتسليك المجارى بالدمام
    شركة طيوب لتسليك المجارى بالقطيف

    ReplyDelete
  52. شركة تاج لمكافحة الحشرات بالدمام تنتشر الحشرات بشكل غير طبيعي في اماكن تواجد الانسان لانها تتغذى على بقايا الطعام والحل معنا في شركة تاج اعرق شركة
    مكافحة حشرات بالدمام هذا لاننا نتخلص من الحشرات بدون رائحة في جميع الاماكن شركة مكافحة الحمام بالدمام والخبر ( بيوت شعر – مدارس – جمعيات – شركات – فلل – قصور – منازل – شقق )
    شركة مكافحة حشرات بالدمام
    شركة مكافحة حشرات بالقطيف
    شركة مكافحة حشرات بالجبيل
    شركة مكافحة حشرات بالخبر
    شركة مكافحة النمل الابيض بالدمام
    شركة مكافحة حشرات بسيهات
    شركة مكافحة حشرات بجازان
    شركة رش مبيدات بجازان
    شركة رش دفان بالدمام

    ReplyDelete


  53. شركة تسليك مجارى بالدمام شركة ركن الامثل 0502644550

    شركة تسليك مجارى بالدمام عزيزى العميل ان مشكلة انسداد المجارى التى تقابل عملائنا الكرام فى حياتنا اليومية لذلك عزيزى العميل باتصالك على شركة ركن الامثل فانك تحصل على خدمة ممتازة واداء مميز من قبل مندوبنا وحل مشكلة الانسداد التى تواجهك عزيزى العميل
    تعتمد شركتنا فى التسليك لبلاعات الحمامات وازالة الدهون المتراكمة فى احواض المطابخ وصفايات المطابخ نعمل داائما على ابادة الشوائب المتراكمة نتيجة غسيل الاوانى والزيوت نتيجة الطهى المستمر بالمطبخ لذلك نعمل جاهدين على تلبية طلبات عملائنا الكرام .
    افضل الطرق التى تقدمها شركتنا فى مجال تسليك المجارى
    تقدم الشركة افضل فريق مخصص لتسليك المجارى فشركتنا لا تقل اهميه عن شركة طيوب لتسليك المجارى بالدمام .
    تقوم الشركة بعمل غسيل لمواسير الصرف الصحى من الدهون وتعمل على اذابتهانهائيا..
    يقوم طاقم العمل الموجود لدى العميل بسكب المواد التى تعمل على تفتيت الدهون واذابتها من داخل مواسير الصرف الصحى..
    من الان وصاعدا من وداعا لمشكلة تسليك المجارى وتسليك مواسير الصرف الصحى تعمل الشركة على توفير افضل انواع الاجهزة وتوفير طاقم فنى متخصص يلبى رغبة دائما عملائنا الكرام نعمل من اجل اراحتك عزيزى العميل بسهولة تامة وباسعار خيالية رخيصة جدا وغير مكلفة.
    ارخص شركة تسليك مجارى بالدمام ويوجد قسم خاص لتسليك البيارات وعمل شفط لها مع رمى المواد لاذابة الدهون وجعل البيارة صالحه للاستخدام ويوجد ضمان يصل الى 5 سنوات.
    شركة مكافحة حشرات بالدمام
    شركة المثالية للتنظيف بالدمام
    شركة المثالية لتنظيف المنازل بالدمام

    ReplyDelete

  54. خدمات شركة ركن الامثل لتسليك المجارى بالقطيف 0502644550



    شركة ركن الامثل لتسليك المجارى بالقطيف 0502644550 شركة تسليك مجارى بالقطيفوالتى تمتلك افضل الادوات المثالية والتى تنافس اقوى الشركات فى مجال
    التسليك ومنها شركة طيوب التى لا تقل شركتنا اهمية عنها من حيث العمالة الفنية المدربه على اعلى مستوى من الخبرة والمهارة
    وامتلاك احدث الادوات والاجهزة الحديثة نعمل فى شركة ركن الامثل ارخص شركة تسليك مجارى بالقطيفعلى حل مشاكل التسليك بافضل الطرق المثالية الممتازة والتى
    تميزنا عن غيرنا فشركة ركن الامثل من افضل شركات التسليك المجارى ويوجد لدينا فنى تسليك مميز وعمالة مدربه على اسس
    عالمية فشركتنا هى احدى افضل الشركات الرائدة في مجال التسليك و الصيانة و التى تقدم افضل خدمة تسليك مجاري داخل افضل شركة تسليك مجارى بالقطيف
    المنازل كل اسرة تدرك اهمية المحافظة على نظافة احواض و مصارف المطبخ و الحمام و بما انك انتي ربة المنزل فتكوني انتي
    سيدة المنزل الاولى فلابد المحافظة على المنزل والتعامل مع افضل الشركات وهى شركة ركن الامثل لتسليك المجارى بالقطيف
    وباقل التكاليف وعدم تكرار المشكله مرة اخرى ويوجد ضمان على التسليك للعملاء شركات تسليك مجارى بالقطيف
    شركة كشف تسربات المياه بالقطيف
    شركة مكافحة حشرات بالقطيف

    ReplyDelete


  55. شركة نقل عفش بالطائف
    شركة المنزل هى شركة نقل اثاث بالطائف لدينا العمالة المدربة التى تقوم بنقل الاثاث بالسيارات المجهزة والمخصصة لخدمات نقل الاثاث بالطائف كما اننا لدينا العمالة المدربة التى تقوم بخدمات تفكيك الاثاث واعادة تركيبه حتى لا يتعرض للخدش او الكسر ونحن مدربون على خدمات نقل الاثاث بالطائف ونقدم جميع خدماتنا بأرخص الاسعار
    شركة نقل اثاث بالطائف
    http://elmnzel.com/moving-furniture-taif/

    ReplyDelete
  56. موسم الصيف اتى بكل ما يحمله من معانى الحرارة المرتفعة والرطوبة التي تجتاح كل الشقق والبيوت والمحلات التجارية وبعد انتهاء فصل الشتاء وتراك الاتربة على الجهاز الخراجي للمكيفات نتيجة لعد تشغيل الجهاز طوال فترة الشتاء يلجا البعض الى الحل الامثل وهو اللجوء الى شركات تنظيف مكيفات اسبليت بالرياض حيث الجميع يلجا الى هذا الحل السريع والفوري لذلك ننصح بالتعامل مع شركة تنظيف مكيفات بالرياض
    افضل شركة على مستوى المملكة في التنظيف بادروا بالاتصال فورا ولا تتترددوا مع شركة الحياه أفضل شركة تنظيف مكيفات اسبليت بالرياض

    ReplyDelete

  57. Good idea! We all know that Styrofoam is full of air and difficult to transport. However, our company INTCO has several machines which can deal with the problem.The machine can compact or melt the Styrofoam into blocks or ingots. And then we can reuse the resources to do other products such as floor bricks. You can get more information from our website: http://www.intcorecycling.com/styrofoam-recycling-solutions.html

    ReplyDelete
  58. Thank You for sharing informative blog with us.

    ReplyDelete
  59. بعمل كل المهام المنزلية التي تعتني بالنظافة و التعطير و التلميع و التعقيم بأقوي مواد التنظيف مع الضمان, اتصل الآن.
    شركة تنظيف منازل بالرياض الاولى والرائدة فى نظافة المنازل بالرياض بأقل التكاليف بيد عاملة محترفة ومدربة علي تنظيف الشقق و البيوت بخصم يصل إلي 40% شركة كشف تسربات المياه بالرياض

    شركة كشف تسربات المياه بعنك
    شركة تنظيف منازل بصفوى

    ReplyDelete
  60. خميس مشيط

    هل تبحثون عن شركة صيانة منزلية شاملة اذ انتم فى المكان الصحيح الان مع فرسان شركة تنظيف بخميس مشيط
    تقدم لكم افضل الخدمات للتنظيف ومكافحة الحشرات فهى ارخص شركة تنظيف فلل بخميس مشيط
    وافضل و شركة تنظيف شقق بخميس مشيط
    وايضا شركة تنظيف مجالس بخميس مشيط
    و شركة تنظيف موكيت بخميس مشيط
    وكذلك نقوم بتنظيف المساجد فنحن افضل شركة تنظيف مساجد بخميس مشيط
    وايضا تقد م لكم خدمات مكافحة الحشرات بجميع انواعها فهى ارخص شركة مكافحة حشرات بخميس مشيط
    وايضا شركة رش مبيدات بخميس مشيط

    وكذلك شركة مكافحة النمل الابيض بخميس مشيط
    فلا تترددوا اتصلوا بنا الان


    ReplyDelete
  61. فرسان المثالى افضل شركة تنظيف بالاحساء0506070763
    احصل على نظافة مثالية من فرسان المثالى افضل

    شركة تنظيف بالاحساء
    شركات النظافة بالاحساء
    شركة تنظيف فلل بالاحساء
    شركة تنظيف منازل بالاحساء
    شركة تنظيف بيوت بالاحساء
    شركة تنظيف شقق بالاحساء
    شركة تنظيف كنب بالاحساء
    شركة المثالية للتنظيف بالاحساء

    http://forsan-almthaly.com/%D8%B4%D8%B1%D9%83%D8%A9-%D8%AA%D9%86%D8%B8%D9%8A%D9%81-%D8%A8%D8%A7%D9%84%D8%A5%D8%AD%D8%B3%D8%A7%D8%A1/

    ReplyDelete
  62. شركة تنظيف بالجبيل 0552744429 السفير المثالى

    شركة تنظيف بالجبيلالسفير المثالي تفتخر أن لديها فريق عمل متكامل لدى شركة تنظيف منازل بالجبيلمن العاملين والعاملات الذين يقومون بتنظيف كل المنازل و كل البيوت و كل الأماكن التي تحتاج إلى تنظيف


    http://almthaly-dammam.com/%D8%B4%D8%B1%D9%83%D8%A9-%D8%AA%D9%86%D8%B8%D9%8A%D9%81-%D8%A8%D8%A7%D9%84%D8%AC%D8%A8%D9%8A%D9%84/

    ReplyDelete
  63. تنظيف بالبخار بمكة - عبير مكة -0508034442
    شركة تنظيف بالبخار بمكة تنظيف بالبخار بمكة عبير مكة تقدم تلك الخدمة لابناء مكة حيث فى الاونة الاخيرة انتشار التنظيف بالبخار بقوة وبفاعلية قوية

    شركة تنظيف مجالس بالبخار بمكة
    شركة تنظيف موكيت بالبخار بمكة
    شركة تنظيف اسطح بالبخار بمكة
    شركة تنظيف واجهات زجاج واسطح بمكة
    تنظيف واجهات زجاج بمكة
    شركة تنظيف اسطح بمكة
    شركة تنظيف ستائر بالبخار بمكة
    شركة تنظيف مقروشات بمكة
    http://abeermakah.com/%D8%AA%D9%86%D8%B8%D9%8A%D9%81-%D8%A8%D8%A7%D9%84%D8%A8%D8%AE%D8%A7%D8%B1-%D8%A8%D9%85%D9%83%D8%A9/

    ReplyDelete
  64. It hasn't been long since we were discussing about core-genomics, and here i find myself looking at a page on the same. This is a very nice and interesting post a page that have given me the best kind of insight. Am sure that my colleagues will also find it very interesting.
    Canadian Research Paper Writers

    ReplyDelete
  65. شركة تنظيف منازل بالخرج
    نوفر العمالة الماهرة والمدربة والملتزمة بوقت العميل لا يوجد لدينا أي تأخير الوقت نحافظ على وقت العميل ولا نهدره يقوم العمال بتنظيف المطبخ والأرضيات وغسيل السجاد وجلي الصحون وتنظيف الحمام وتنظيف الستائر لدينا خدمة شاملة نستطيع إنجازها وتقديمها في أسرع وقت ممكن

    ReplyDelete
  66. مؤسسة الحرمــين تعتبر افضل شركة متخصصة في كشف تسربات المياه في منزلك بدون تكسير بالحوائط والجدران في الحمامات أو المطابخ أو أي مكان أخر فى الادوارالعليا أو الأدوار السفلى يتعرض للتسرب داخل منزلك وذلك لأننا نستخدم أفضل وأحدث الأدوات الإلكترونية والتكنولوجيا الحديثة لكشف التسرب بدون عناء مما يؤدي إلى توفير الوقت والمجهود والمال أيضاً حيث يؤدي ذلك إلى تقليل التكلفة وسوف تتعرف على اسباب تسرب المياه . ,وفي حالة تعرضكم لأي تسريبات على الإطلاق ، نتمنى الاتصال بنا في أي وقت.

    شركة كشف تسربات المياه بالاحساء

    ReplyDelete

Note: only a member of this blog may post a comment.